Alarma Blue細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

Alarma Blue細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒AlamaBlue 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒提供了一種可靠、靈敏、安全和低成本的快速有效檢測(cè)細(xì)胞活力與毒性的方法。AlamaBlue 通過(guò)在細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的化學(xué)還原反應(yīng)，將非熒光信號(hào)的染料轉(zhuǎn)換成為一紅色熒光物質(zhì)，試鹵靈（9-羥基-3-異吩惡嗪酮7-羥基-3H-吩惡嗪-3-酮），從而檢測(cè)細(xì)胞的存活率。維持細(xì)胞需要還原性環(huán)境而抑制生長(zhǎng)則表現(xiàn)為氧化型環(huán)境。細(xì)胞生長(zhǎng)率相關(guān)的降低可表現(xiàn)為氧化還原指示劑從氧化型（非熒光素、紫色）轉(zhuǎn)為還原型（熒光素、紅色）。該熒光信號(hào)可以用530~560nm 的激發(fā)波激發(fā)，在590nm 處可以獲發(fā)射波，檢測(cè)570 和600nm 的的吸光度值，校正監(jiān)測(cè)值，可以減去相應(yīng)的570nm 和600nm 的背景吸光度值。檢測(cè)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)是與樣品中的活細(xì)胞數(shù)成正比的。

AlamaBlue 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒的靈敏度相似于[3H]胸苷法檢測(cè)細(xì)胞增殖法。根據(jù)不同類型的細(xì)胞，AlamaBlue 可以檢測(cè)到至少40個(gè)細(xì)胞，同時(shí)保證很好的重現(xiàn)性和靈敏度。作為試鹵靈（紫紅、紅色熒光）可以進(jìn)一步被還原為水解化的試鹵靈（無(wú)色、無(wú)熒光），當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增多，所有的刃天青（7-羥基-3-羰基-10-氧化-三氫吩惡嗪）被轉(zhuǎn)換為試鹵靈（9-羥基-3-異吩惡嗪酮7-羥基-3H-吩惡嗪-3-酮），試劑盒的信號(hào)反而會(huì)發(fā)生衰減。因此，對(duì)于您所用的試劑盒來(lái)說(shuō)，針對(duì)不同的細(xì)胞類型，應(yīng)該調(diào)整您的細(xì)胞數(shù)，做相應(yīng)的優(yōu)化，才能得到更好的結(jié)果。

操作說(shuō)明

以下操作可用作通用指導(dǎo)建議。考慮不同細(xì)胞類型與培養(yǎng)條件的差異性，有必要根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化您的操作步驟。

1. 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔100μL 培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞，控制細(xì)胞數(shù)目在40~10000 個(gè)/貼壁細(xì)胞，2000~500000 個(gè)/懸浮細(xì)胞。設(shè)置空培養(yǎng)基做對(duì)照。

2. 加入10μL AlamaBlue 溶液至培養(yǎng)基中，37 度孵育：24 小時(shí)（比色法讀數(shù)）；5-6 小時(shí)（熒光讀數(shù)）。

3. 檢測(cè)570nm 和600nm 的吸光度，或者用熒光微孔板讀數(shù)530nm 激發(fā)，590nm 發(fā)射波讀數(shù)。

4. 如果采用比色法檢測(cè)，選擇OD570-OD600 檢測(cè)，如果檢測(cè)熒光信號(hào)，請(qǐng)?jiān)谛Ｕ齇D 值后，先設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇合適您實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞最佳濃度。

Alarma Blue細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)：

1、懸浮細(xì)胞用此法時(shí)必須經(jīng)離心后才能吸出上清再加DMSO。

2、Formazan 的生成不僅與活細(xì)胞數(shù)成比例，也受作用時(shí)間的影響，因此當(dāng)樣品較多時(shí)測(cè)定的OD 值可能隨時(shí)間而變。

3、MTT 溶液為黃色，需避光保存，長(zhǎng)時(shí)間光照會(huì)導(dǎo)致失效。當(dāng)顏色變?yōu)榛揖G色時(shí)，請(qǐng)勿使用。MTT 溶液在4℃或較低溫度情況下會(huì)凝固，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

4、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

 a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

試劑盒使用注意說(shuō)明：

1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

2.最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

3.不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，網(wǎng)站電子版說(shuō)明書(shū)僅作參考。

4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。

5.本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

6.使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

7.若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測(cè)不出的情況。

8.某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測(cè)抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測(cè)出。